Gıda Takviyeleri

Tribulus terrestris’ten izole edilen N ‑ trans ‑ ρ ‑ caffeoyl tiramin

Öz

Enflamasyon, romatoid artrit, astım ve inflamatuar bağırsak hastalığı gibi kronik enflamatuar hastalıkların önemli bir aracısı olan siklooksijenaz ‑ 2’nin (COX ‑ 2) ekspresyonuyla indüklenir. Tribulus terrestris’in (T. terrestris) enflamatuar hastalıklar üzerinde faydalı bir etkisi olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, T. terrestris’den izole edilen N ‑ trans ‑ ρ ‑ caffeoyl tiramin (CT) ‘nin nitrik oksit (NO) üretimi ve lipopolisakkaritte pro ‑ inflamatuar sitokinler ve COX ‑ 2 ekspresyonu üzerindeki etkileri araştırıldı ( LPS) uyarılmış RAW 264.7 hücreleri. Aynı zamanda ilgili moleküler mekanizmaları açıklamayı amaçladık. T. terrestris (EETT) ve CT’nin etanolik ekstresinin LPS ‑ ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde NO, tümör nekroz faktörü ‑ α (TNFa α), interlökin (IL) ‑6 ve IL ‑ 10 üretimini inhibe ettiğini bulduk. doza bağımlı bir şekilde. Bunlar, ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve enzime bağlı immünosorban analizi (ELISA) ile belirlenmiştir. Ek olarak CT, LPS stimülasyonuna yanıt olarak COX ‑ 2 ekspresyonunu ve prostaglandin E2 (PGE2) üretimini önemli ölçüde bastırdı. Ayrıca, CT LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde p ‑ c ‑ Haziran N ‑ terminal kinaz (p ‑ JNK) protein ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. Western blot analizi ile COX-2 ve p-JNK ölçüldü. Birlikte ele alındığında, bu bulgular T. terrestris’den izole edilen BT’nin, inflamatuar yanıtların yeni ve güçlü bir modülatörü olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, BT’nin kronik inflamatuar hastalıklar için olası bir tedavi olarak daha fazla değerlendirilmesi yararlı olabilir. CT, LPS stimülasyonuna yanıt olarak COX ‑ 2 ekspresyonunu ve prostaglandin E2 (PGE2) üretimini önemli ölçüde bastırdı. Ayrıca, CT LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde p ‑ c ‑ Haziran N ‑ terminal kinaz (p ‑ JNK) protein ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. Western blot analizi ile COX-2 ve p-JNK ölçüldü. Birlikte ele alındığında, bu bulgular T. terrestris’den izole edilen BT’nin, inflamatuar yanıtların yeni ve güçlü bir modülatörü olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, BT’nin kronik inflamatuar hastalıklar için olası bir tedavi olarak daha fazla değerlendirilmesi yararlı olabilir. CT, LPS stimülasyonuna yanıt olarak COX ‑ 2 ekspresyonunu ve prostaglandin E2 (PGE2) üretimini önemli ölçüde bastırdı. Ayrıca, CT LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde p ‑ c ‑ Haziran N ‑ terminal kinaz (p ‑ JNK) protein ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. Western blot analizi ile COX-2 ve p-JNK ölçüldü. Birlikte ele alındığında, bu bulgular T. terrestris’den izole edilen BT’nin, inflamatuar yanıtların yeni ve güçlü bir modülatörü olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, BT’nin kronik inflamatuar hastalıklar için olası bir tedavi olarak daha fazla değerlendirilmesi yararlı olabilir. bu bulgular T. terrestris’den izole edilen BT’nin inflamatuar yanıtların yeni ve güçlü bir modülatörü olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, BT’nin kronik inflamatuar hastalıklar için olası bir tedavi olarak daha fazla değerlendirilmesi yararlı olabilir. bu bulgular T. terrestris’den izole edilen BT’nin inflamatuar yanıtların yeni ve güçlü bir modülatörü olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, BT’nin kronik inflamatuar hastalıklar için olası bir tedavi olarak daha fazla değerlendirilmesi yararlı olabilir.

Giriş

Tribulus terrestris ( T. terrestris ), halk tıbbında çeşitli kullanımlara sahip bitkisel bir ilaçtır. Geleneksel tıpta, T. terrestris’ten elde edilen ekstrakt, hipertansiyon, koroner kalp hastalığı ( 1 ), mantar hastalıkları ve her iki cinsiyette infertilite gibi çeşitli hastalıkları tedavi etmek için kullanılmıştır ( 2 , 3 ). Ayrıca azalmış karaciğer fonksiyonunu düzeltmeye yardımcı olabilecek oldukça değerli bir ilaç olarak tanımlanmıştır ve diyabet ve hiperlipidemi tedavisinde kullanılmaktadır ( 4 , 5 ). Geleneksel Çin tıbbında, T. terrestris’in meyvesi kaşıntı, ödem, tracheitis ve iltihabı tedavi etmek için kullanılmıştır ( 6). N-trans -ρ-kafeoil tiramin (CT), T. terrestris ( 7 ) ‘ den izole edilen bileşiklerden biridir . Önceki bir çalışma BT’nin bir antioksidan olarak hareket ettiğini ve asetilkolinesterazı in vitro ve in vivo olarak orta derecede inhibe ettiğini bildirmiştir ( 8 ). Bununla birlikte, BT’nin antienflamatuar etkileri henüz tam olarak aydınlatılamamıştır.

Enflamasyon, lökositler, makrofajlar ve mast hücreleri gibi çeşitli bağışıklık hücrelerini içeren çeşitli moleküllerin aracılık ettiği karmaşık bir patolojik süreçtir ( 9 ). Nitrik oksit (NO) ve prostaglandin E 2 (PGE 2 ) inflamasyon ve uyarılabilir NO sentazı (iNOS) ve bir siklooksijenaz-2 dahil olmak üzere çeşitli patofizyolojik süreçlerde, katılan (COX-2) Bu büyük miktarlarda üretimi için esas olarak sorumlu arabulucular ( 10 , 11 ). NO sentazın (NOS) kurucu izoformu tarafından üretilen NO, homeostazın önemli bir düzenleyicisidir; ancak, iNOS tarafından NO oluşumu inflamasyonda önemli bir rol oynar ( 12). Aktive makrofajlar, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ve NO ve PGE 2 gibi enflamatuar aracılar da dahil olmak üzere aşırı derecede pro-enflamatuar sitokinler ürettiklerinden enflamatuar hastalıklarda önemli bir rol oynarlar ( 13 , 14 ). PGE 2 bir başka önemli enflamatuar aracıdır ve araşidonik asit metabolitlerinden COX-2’nin katalizi ile üretilir ( 15 ). PGE 2 , akut ve kronik inflamatuar durumların patogeneziyle ilişkilidir ( 16 ) ve spesifik COX-2 inhibitörleri, inflamasyon semptomlarını azaltır ( 17 ).

Bu çalışmada T. terrestris’ten izole edilen BT’nin lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılmış RAW 264.7 hücreleri üzerindeki anti-enflamatuar etkilerini inceledik . Bulgularımız BT’nin NO üretimini inhibe ettiğini ve LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde inflamasyonla ilişkili COX-2 ve sitokin ekspresyonunu baskıladığını göstermiştir.

Malzemeler ve yöntemler

T. terrestris özütünün hazırlanması

T. terrestris’in (Fructus Tribuli ) kurutulmuş meyvesi Mart 2012’de Seul, Kore’deki Gyeongdong oryantal Bitkisel Mağaza’dan satın alındı ​​ve resmen Profesör Joa Sub Oh (Eczacılık Koleji, Dankook Üniversitesi, Cheonan, Kore) tarafından tanımlandı. Kore, Suwon, Gyeonggi Bilim ve Teknoloji Tanıtımı Enstitüsü Doğal Ürünler Araştırma Laboratuvarı’na bir makbuz örneği (G46) konuldu. Havayla kurutulmuş, ezilmiş T. terrestris meyveleri (10 kg) toz haline getirildi ve özüt, oda sıcaklığında (2 gün boyunca günde iki kez)% 80 etanol (EtOH; 3×18 litre) ile çıkarıldı.

BT ekstraksiyonu ve izolasyonu

% 80 EtOH özü süzüldü ve 673.5 g tortu verecek şekilde 40 ° C’de vakumla konsantre edildi ve tortu, daha sonra su içerisinde süspanse edildi ve heksanla (3×1.5 litre), heksanda çözünür bir katman (40 g) verecek şekilde paylaştırıldı. ). Sulu tabaka CHC ile bölünmüştür 3 bir CHC temin etmek üzere 3 ‘te çözünürlüğe sahip bir tortu (8.1 g) verdi. CHC 3 tabaka CHC kullanılarak [silika jel (230-400 meş) ile dolu bir cam sütunun (7 x 20 cm)], sıvı kromatografisine tabi tutuldu ve 3 MeOH (100: 0 ila 99: 1, 98: 2, 97: 3 , 96: 4, 94: 6, 92: 8, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50; h / h) elüent olarak gradyan karışımları. Eluent fraksiyonlar G46-51- ( 1 – 13), bu başlangıçtaki sıvı kromatografik ayırmadan elde edildi. F001-F011 fraksiyonları , NO inhibitör aktivitelerini değerlendirmek için bir in vitro biyo -tahlile tabi tutuldu . G46-51-7 fraksiyonu, NO üretimine karşı ümit verici inhibe edici aktivite sergiledi ve bu nedenle daha fazla analiz için seçildi. CHC sütun kromatografisi 3 artan polarite ile, MeOH kullanılarak bir silis jel üzerinde ‘te çözünürlüğe sahip bir tabaka (8.1 g), 13 fraksiyonlar, G46-51- sonrasında ( 1 – 13 ). Fraksiyon G46-51-7 (2.71 g) daha fazla CHC kullanılarak bir Sephadex LH-20 kolonu üzerinde flaş kolon kromatografisi uygulanmış 3 MeOH (1: 1) ve 21 fraksiyonlar kaydedildi: G46-52- ( 1 – 21). Bu 21 fraksiyonlar, CT (97.5 mg), CHC ile çöktürülerek, fraksiyon G46-52-12, izole edilmiş 3 . 1 H- ve 13 C-NMR spektrumları, bir çözücü olarak CDCI3 kullanılarak bir Bruker Ascend 700 MHz spektrometre (Bruker, Billerica, MA, ABD) üzerine kaydedilmiştir. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrumları bir LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Bremen, Almanya) kütle spektrometresinde elde edildi.

N-trans-ρ-kafeoil tiramin (CT)

Amorf toz; 1 ‘H-NMR (CD 3 OD, 700 MHz) δ: 7.40 (1H, d, J = 15.4 Hz, H-7′), 7.07 (2H, d, J = 8,4 Hz, H-2, 6), 7.01 (LH, d, J = 1.4 Hz, H-2 ′), 6.92 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-6 ′), 6.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5 ′ ), 6.74 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3, 5), 6.35 (1H, d, J = 15.4 Hz, H-8 ′), 3.47 (1H, t, J = 7.0 Hz, H- 7), 2.77 (IH, t, J = 7.0 Hz, H-8); 13 ° C-NMR (CD 3OD, 175 MHz) δ 167.9 (C-9 ′), 155.5 (C-4), 147.3 (C-4 ′), 145.3 (C-3 ′), 140.8 (C-7 ′), 129.9 (C-1 8), 129.3 (C-2, 6), 126.9 (C-1), 120.7 (C-6 ′), 117.0 (C-8 ′), 115.0 (C-5 114), 114.8 (C-3, 5 ), 113.6 (C-2p), 41.1 (C-8), 34.4 (C-7); ESI kütle spektrometresi (ESIMS; negatif) m / z 298 [MH]  ( 18 ). CT’nin yapısı Şekil 1A’da sunulmaktadır .

Şekil 1

N-trans-ρ-kafeoil tiramin (CT) ‘nin lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde nitrik oksit (NO) üretimi ve sitotoksisite üzerine etkileri. (A) BT’nin Yapısı. (B) LPS ile stimülasyondan sonra, RAW 264.7 hücreleri 24 saat boyunca 0, 5, 25 veya 50 μM CT ile muamele edildi. Griess reaktifi kullanılarak NO analizi gerçekleştirildi. (C) Hücre canlılığı MTT deneyi ile belirlendi. Deneylerin sonuçları 3 bağımsız deneyin ortalama değerleridir ve işlenmemiş hücrelerin yaşayabilirliğine kıyasla hücre yaşayabilirliği yüzdesi olarak gösterilmiştir. * P <0.05 ve ** P <0.01, LPS ile tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldığında.

Reaktifler

Aşağıdaki farmakolojik maddeler ve antikorlar, ticari kaynaklardan satın alınmıştır: LPS E. coli serotip 0111: B4, selekoksib, N- G , Sigma-Aldrich, St. Louis -monom etil-L-arjinin (L-NMMA) ve deksametason (hepsi MO, ABD); anti-COX-2 (M-19; sc-1747), anti-p-aktin (13E5) ve anti-GAPDH antikorları ve keçi ve fare IgG-yaban turpu peroksidaz konjugatları (hepsi Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz’dan , CA, ABD); anti-c-Jun N-terminal protein kinazı (JNK; # 9251) ve anti-fosfo-JNK (Thr183 / Tyr185) antikorları (her ikisi de Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ABD’den).

Hücre kültürü ve NO analizi

RAW 264.7 sıçangil makrofajları (TIB-71), Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (ATCC, Manassas, VA, ABD) satın alındı. Hücreler,% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde muhafaza edilmiştir (FBS, her ikisi de Gibco dan ® Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, ABD), 100 U / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin (Gibco her iki ® % 5 CO% 95 hava içeren nemli bir atmosferde, Life Technologies, Inc.), 2 , 37 ° C’de ilave edildi. 0. günde, hücreler 96 oyuklu plakalara ekildi. 24 saat sonra, hücreler (0.5 ortam ile uyarıldı μ , 2 saat boyunca% 10 FBS DMEM / ml LPS) ve daha sonra bu ortam, bakım ortamında (% 10 FBS DMEM) ile değiştirildi. Hücreler çeşitli CT konsantrasyonları ile tedavi edildi (0-50μ M) 24 saat süreyle. Daha sonra Griess reaktifi (% 1 sülfanilamid ve% 0.1 N- (1-naftil) etilendiamin dihidroklorür kullanarak% 2.5 fosforik asit; Sigma-Aldrich kullanılarak stabil bir NO metaboliti olan nitrit seviyelerini ölçtük. Daha sonra karışım, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edildi ve absorbans, 540 nm’de ölçüldü. Nitrit miktarı, sodyum nitrit (Sigma-Aldrich) için standart bir eğriden belirlendi.

Hücre sitotoksisite deneyi

RAW 264.7 hücrelerinde in vitro hücre canlılığının belirlenmesi için 3- [4,5-dimetiltiyazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolium bromür (MTT; Sigma-Aldrich) deneyi kullanıldı . Hücreler 4 x 10 bir yoğunlukta plakalandı 4 hücre / oyukta 100 μ l kültür ortamı. Kaplamadan bir gün sonra bir zaman sıfır kontrol plakası yapıldı. 2 st için LPS ile hücrelerinin uyarılmasını takiben, CT tatbik edildi ve hücreler, CO% 5 nemli bir atmosferde 24 saat boyunca inkübe edilmiştir 237 ° C’de. Daha sonra hücre kültürü yapıldı. Her bir oyuğa MTT (PBS içinde 5 mg / ml) ilave edildikten sonra 90 dakika süreyle inkübasyon yapıldı. Ortam, kuyulardan aspirasyon ile çıkarıldı; daha sonra, her oyuğa 0.1 ml tamponlu dimetil sülfoksit (DMSO; Sigma-Aldrich) ilave edildi ve plakalar çalkalandı. Absorbans, 540 nm’de bir mikrotitre plaka okuyucu üzerinde ölçüldü.

Enzime bağlı immünosorban testi (ELISA)

RAISA 264.7 hücrelerinde in vitro sitokin seviyelerinin belirlenmesi için ELISA yapıldı . Hücreler 4 x 10 bir yoğunlukta plakalandı 4 hücre / oyukta 100 μ l kültür ortamı. Kaplamadan bir gün sonra bir zaman sıfır kontrol plakası yapıldı. 2 st için LPS ile hücrelerin uyarılması sonra BT tatbik edildi ve hücreler,% 5 CO içeren nemli bir atmosfer içinde 24 saat inkübe edildi 2 37 ° ° C. Daha sonra hücre kültürü yapıldı. Üst fazlar toplandı ve sitokinler için ELISA ile analiz edildi. Kültür ortamında interlökin (IL) -6, IL-10 ve TNF-a konsantrasyonları, bir platin ELISA kiti (eBioscience, San Diego, CA, ABD) ve PGE 2 konsantrasyonu kullanılarak ölçüldü kültür ortamında, üreticinin talimatlarına göre sırasıyla rekabetçi bir enzim ELISA kiti (R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) kullanılarak nicelendirildi.

RNA ekstraksiyonu ve ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR)

Toplam RNA, toplam RNA ekstraksiyon kiti (Ambion, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak özümlendi. SuperScript ™ III Tek Adım RT-PCR sistemi (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak her bir RT-PCR reaksiyonu için bir şablon olarak beş mikrogram RNA kullanılmıştır. Yeni spesifik primerler kullanılarak çoğaltılmıştır RAW 264.7 kontrol hücreleri ve BT ile işlenmiş hücrelerden bir cDNA sentez Accupower ® Pfu PCR ön karışım (Bioneer, Daejeon, Kore). RT-PCR için kullanılan primer dizileri Tablo I’de gösterilmektedir .

Tablo I

RT-PCR için kullanılan primer sekansı.

Western blot analizi

Hücreler toplandı ve PBS ile yıkandı ve daha sonra 13 ° rpm’de 1 dakika süreyle 4 ° C’de santrifüj yoluyla toplandı. Hücre lizatı elde etmek için hücreler, RIPA tamponu [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl,% 1 NP-40,% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 mM ditiyotreitol içerisinde 30 dakika boyunca buz üzerinde lize edildi. Proteaz inhibitörleri (Roche, Mannheim, Almanya) içeren (DTT) ve 1 mM fenilmetansülfonil florür (PMSF)]. Çözünmeyen malzemeler, 4 ° C’de 10 dakika boyunca 13.000 rpm’de santrifüjleme yoluyla çıkarıldı. Toplam 50 mg süpernatan,% 10 SDS, 1.5 M Tris-HCl,% 0.035 N, N, N′, N = içeren% 10 poliakrilamid jel kullanılarak ayrıldı. -tetrametilendiamin ve 7 mg amonyum persülfat. Ayrılan proteinler, 39 mM glisin, 48 mM Tris bazı,% 0.037 SDS ve% 20 MeOH içeren bir transfer tamponu içinde 36 mA’da bir nitroselüloz membrana (Whatman, Dassel, Almanya) elektriksel olarak aktarıldı. Tüm western blot analizleri en azından üç kez yapıldı ve temsili lekeler gösterildi.

istatistiksel analiz

Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi. Deney sonuçlarının istatistiksel önemi analiz edildi (bir sonraki Dunnett çoklu aralık testi ile Student t-testi ve tek yönlü ANOVA). P değerinin <0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterdi.

Sonuçlar

BT’nin LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde NO üretimi ve sitotoksisite üzerine etkileri

CT’nin kimyasal yapısı Şekil 1A’da gösterilmiştir . Enflamatuar yanıtına CT etkisini incelemek için, LPS tedavisinin ardından NO üretiminin düzeyleri ölçüldü (0.5 μ / ml) – (0, 5, 25 ya da 50 CT ile RAW 264.7 hücreleri stimüle μ 24 için M) h. BT ile tedavi, doza bağlı bir şekilde LPS ile uyarılan hücrelerde NO seviyelerinde belirgin bir azalmaya neden olmuştur. 50 μ M CT ile yapılan tedavi NO üretiminde% 84.07’lik bir azalmaya neden olmuştur. Ayrıca, bu sonuç, 100 ile muamele ile elde edilene benzer olduğunu teyit μ M L-NMMA ( Şek. 1B aynı zamanda, daha önce gösterilmiştir () 19). BT’nin sitotoksisitesini değerlendirmek için bir MTT testi yaptık. 5, 25 veya 50 ile yapılan tedavi, μ M CT üzerinde önemli bir sitotoksik etkiye sahip değildi RAW 264.7 hücreleri (LPS ile uyarılmış Şek. 1 C ).

BT’nin LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde sitokinlerin ekspresyonu ve üretimi üzerindeki etkileri

CT’nin LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde pro-enflamatuar sitokin olan TNF-a, IL-6 ve IL-10 ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırdık. İlk olarak, 5, 25 ya da 50 ile muamelenin ardından, RT-PCR ile, TNF-a mRNA ekspresyon seviyelerini, IL-6 ve IL-10 ölçülür μ M CT. BT ile tedavinin, TNF-a, IL-6 ve IL-10’un mRNA seviyelerini doza bağlı bir şekilde baskıladığını gözlemledik ( Şekil 2A ). Steroid ilaçların glukokortikoid sınıfının güçlü bir sentetik üyesi olan deksametazon (25 μ M) ile tedavi ayrıca TNF-a, IL-6 ve IL-10’un mRNA ekspresyonunu inhibe etti ( Şekil 2A)). Daha sonra CT’nin protein seviyesinde TNF-a, IL-6 ve IL-10 üzerindeki etkilerini ELISA ile doğruladık. Kıvamlandırılmış ortam maddesi içinde TNF-a protein seviyeleri, IL-6 ve IL-10 5, 25 ya da 50 ile tedaviyi takiben düşmüştür μ M CT. Özellikle, 50 ile tedavi μ M CT anlamlı olarak sırasıyla 44.13, 18.38 ve 84.99% (en çok TNF-a salınmasını, IL-6 ve IL-10 inhibe Şek. 2B-D ).

şekil 2

N-trans-ρ-kafeoil tiramin (CT) ‘nin lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılmış RAW 264.7 hücrelerinde enflamatuar sitokinlerin ekspresyonu üzerine etkileri. Stimülasyonun ardından, RAW 264.7 hücreleri 24 saat boyunca 0, 5, 25 veya 50 uM CT ile muamele edildi. (A) Tümör nekroz faktörü-a (TNF-a), interlökin (IL) -6 ve IL-10’un temsili mRNA seviyeleri RT-PCR ile değerlendirildi. CT’nin (B) TNF-a, (C) IL-6 ve (D) IL-10 üretimi üzerindeki inhibe edici etkileri, enzime bağlı immünosorban testi (ELISA) ile değerlendirildi. Değerler 3 bağımsız deneyin ortalama ± SD’sini temsil eder. * P <0.05 ve ** P <0.01, LPS ile tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldığında.

CT’nin LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde mitojenle aktifleştirilen protein kinazın (MAPK) COX-2 ekspresyonu ve fosforilasyonu üzerine etkileri

COX-2 ifadesi üzerindeki CT etkisini belirlemek için, COX-2 ifadesi, mRNA ve protein seviyesinde hem de düşük olup olmadığını muayene 5, 25 ya da 50 ile muamelenin ardından RAW 264.7 hücreleri, LPS ile uyarılmış μ CT’nin M. Şekil 3A’da gösterildiği gibi CT, COX-2 mRNA ekspresyonunu doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde inhibe etti. 5 ile tedavi μ selekoksibin M, iyi bilinen bir COX-2 inhibitörü, mRNA düzeyinde önemli ölçüde engellemiştir COX-2 ifadesi. Ek olarak, 5, 25 ya da 50 ile tedavi μ western blot analizi ile kanıtlandığı gibi M CT, doza bağımlı bir şekilde protein düzeyinde COX-2 ekspresyonunun bastırılması ile sonuçlanmıştır. Selekoksib ile tedavi ayrıca COX-2 protein ekspresyonunu önemli ölçüde inhibe etti ( Şekil 3B)). Çalışmalar, MAPK’lerin LPS ile indüklenen fosforilasyonunun, enflamatuar sitokinlerin üretimine yol açtığını göstermiştir ( 20 , 21 ). Böylece, MAPK yolunun aktivasyonunun BT tarafından düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için JNK’nın fosforilasyon seviyelerini ölçtük. BT ile tedavi (özellikle 50 μ M CT ile), JNK’nın LPS kaynaklı fosforilasyonunu önemli ölçüde inhibe etti, ancak JNK ekspresyonunu etkilemedi ( Şekil 3C ).

Figür 3

Lipopolisakkarit (LPS) uyarılmış RAW 264.7’de siklooksijenaz-2 (COX) -2’nin ekspresyonu ve c-Jun N-terminal protein kinazının (JNK) fosforilasyonu üzerine N-trans-ρ-kaffeoil tiramin (CT) ‘nin etkisi hücreler. Stimülasyonun ardından, RAW 264.7 hücreleri 24 saat boyunca 0, 5, 25 veya 50 uM CT ile muamele edildi. CT ile tedavi edilen hücreler, işlenmemiş hücrelerle karşılaştırıldığında (A) COX-2 mRNA ekspresyonunda ve (B) COX-2 protein ekspresyonunda ve (C) JNK fosforilasyonunda bir azalma sergiledi. Bu etkiyi kantitatif densitometrik analiz kullanarak doğruladık. Değerler 3 bağımsız deneyin ortalama ± SD’sini temsil eder. * P <0.05, LPS ile tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldığında.

BT’nin LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde PGE2 seviyesi üzerindeki etkileri

CT’nin COX-2 tarafından üretilen aracılardan biri olan PGE 2 üzerindeki etkilerini doğrulamak için , LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinin CT (5, 25 veya 50 μ M) ile tedavisinden sonra PGE 2’nin salgılama seviyelerini ölçtük ve selekoksib (5 μ M). Şartlandırılmış ortam toplandı ve PGE 2 içerik ELISA ile ölçüldü. Gösterildiği gibi , Şekil. 4 , PGE seviyeleri 2 ortamı içinde önemli ölçüde (50 CT ile tedavi sonrası düşmüştür μ (5 M) ve selekoksib μ M).

Şekil 4

Lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde prostaglandin E2 (PGE2) üretimine N-trans-ρ-kaffeoil tiramin (CT) etkisi. Stimülasyonun ardından, RAW 264.7 hücreleri 24 saat boyunca 0, 5, 25 veya 50 uM CT ile muamele edildi. RAW 264.7 hücrelerinden PGE2 salgılanması, enzime bağlı bir immünosorban analizi (ELISA) kullanılarak belirlendi. Değerler 3 bağımsız deneyin ortalama ± SD’sini temsil eder. * P <0.05, LPS ile tedavi edilen hücrelerle karşılaştırıldığında.

Tartışma

Bu çalışmada, T. terrestris’ten izole edilen BT’nin , LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerindeki inflamatuar yanıt ve ilgili pro-enflamatuar sitokin seviyeleri üzerinde belirgin bir etkisi olduğunu gösterdik. İlk olarak bir% 80 etanol özü T. terrestris (EETT) ‘nin bir NO testi kullanarak enflamatuar yanıt üzerindeki etkilerini inceledik ve LPS ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde NO üretiminin doza bağlı baskılanmasını gözlemledik (veriler gösterilmemiştir) ). Önceki bir çalışma, T. terrestris’in promotör tahlili kullanarak COX-2 ekspresyonunu inhibe ettiğini gösterdi ( 22). Bu çalışmada BT’yi EETT’den izole ettik ve RAW 264.7 murin makrofajları üzerindeki anti-inflamatuar etkilerini inceledik. BT ile tedavinin, LPS ile uyarılmış makrofajlarda NO üretiminde azalmaya neden olduğunu ve deney koşullarımızda sitotoksisiteye neden olmadığını gösterdik. Ayrıca 100 ile tedavi olduğu görülmüştür μ M L-NMMA, iyi bilinen bir NOS inhibitörü, LPS ile uyarılmış makrofajlar (NO üretimi azalma Şek. 1B ).

Makrofajların ev sahibi savunma mekanizmasında önemli bir rol oynadığı bilinmektedir; interferon-y, pro-enflamatuar sitokinlere ve bakteriyel LPS’ye maruz bırakılarak aktive edilirler ( 10 ). NO, NOS tarafından L-NMMA’dan endojen olarak üretilir ve bir dizi fizyolojik sürecin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ( 23 ). TNF-a, IL-6 ve IL-10, en önemli pro-enflamatuar sitokinlerdir. Sitokinler, TNF-a, IL-6 ve IL-10, esas olarak aktif monositler veya makrofajlar tarafından üretilir ( 24). Bu çalışmada, LPS ile uyarılan hücrelerin uyarılmamış hücrelere kıyasla pro-enflamatuar sitokinlerin ekspresyon seviyelerinin ve üretiminin arttığını gösterdik. Verilerimiz, CT ile tedavinin mRNA seviyesinde TNF-a, IL-6 ve IL-10 ekspresyonunu azalttığını gösterdi ( Şekil 2A ) ve TNF-a, IL-6 ve IL-10’un salgılanmasını bastırdı. LPS ile muamele edilmiş makrofajlardaki protein seviyesi ( Şekil 2B ).

Glukokortikoidler, pleiotropik etkileri olan bir steroid hormon sınıfıdır. Farmakolojik konsantrasyonlarda, glukokortikoidler enflamasyonu ve bağışıklık sisteminin aktivasyonunu önlemek ve bastırmak için kullanılır. Steroidler, antienflamatuar etkilerini temel olarak enflamatuar süreçleri kontrol etmede yer alan çeşitli genlerin transkripsiyonunu modüle ederek uygularlar ( 25 ). Sonuçlarımız, glukokortikoidlerden biri olan deksametazon ile yapılan tedavinin, TNF-a, IL-6 ve IL-10 seviyelerinde sırasıyla% 81.39, 22.19 ve 93.13’e kadar bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir ( Şekil 2B – D ). Bununla birlikte, glukokortikoidlerin ciddi yan etkileri olduğu bilinmektedir ( 26 ) ve bu nedenle amacımız doğal kaynaklardan bir ilaç elde etmekti.

Prostaglandinler (PG) anahtar enflamatuar aracılardır; araşidonik asidin COX ile dönüştürülmesinden üretilirler. İki COX izoformu vardır: COX-1 ve COX-2 ( 27 ). COX-1, normal fizyolojik koşullar altında yapısal olarak eksprese edilen izoformdur, oysa COX-2, sitokinler ve bakteri endotoksin LPS gibi enflamatuar sinyallere yanıt olarak eksprese edilir. Bir COX-2 seçici inhibitörü olan selekoksib, akut ağrı ve kronik enflamatuar hastalıkların, özellikle artritin tedavisinde faydalı bir ilaçtır ( 28 ); ancak, çeşitli yan etkilere neden olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, 25 ya da 50 ile hücrelerinin tedavisinin göstermiştir μ CT M, ya da 5 ^ ıM selekoksib, mRNA ve protein seviyesinde COX-2 ekspresyonunu inhibe etti ( Şekil 3A ve B ). Bu bulgular, T. terrestris’den izole edilen BT’nin bir COX-2 seçici inhibitörü olarak hareket ederek terapötik bir etki yaptığını ve enflamatuar yanıtları önlediğini ve bu nedenle enflamatuar hastalıkların tedavisinde kullanılabilecek potansiyel olarak güvenli doğal olarak türetilmiş bir ilaç olabileceğini düşündürmektedir. Salvemini ve arkadaşları , NO’nun COX-2’nin aktivitesini modüle ettiğini ve COX-2’yi aktive ederek PGE 2’nin salınmasında rol oynadığını bildirmiştir ( 29 ). COX-2 PGE büyük miktarlarını üreten 2 iltihabik bir cevabı (indükleyen 17 ). Bu nedenle, inflamatuar aracı PGE 2’nin serbest bırakılmasıCOX-2 aktivasyonu ile desteklenir. Sonuçlarımız BT (50 μ M) ile tedavinin PGE 2 düzeylerinde % 32,70’lik bir düşüşe neden olduğunu göstermiştir ( Şekil 4 ). Bu sonuçlar, CT, PGE inhibisyonu COX-2 ekspresyonunun, sonuç bastırılması bir anti-inflamatuar bir etkiye sahip olduğu göstermektedir 2 sentezi.

Sonuç olarak, bu çalışmada CT’nin TNF-α, IL-6 ve IL-10 gibi NO ve pro-enflamatuar sitokinlerin üretiminin baskılanması yoluyla makrofaj aracılı enflamatuar yanıtları belirgin şekilde inhibe edebildiğini gösterdik. Ayrıca, CT COX-2, JNK ve PGE fosforilasyonu ekspresyonunu inhibe 2 sentezi. Bu bulgular BT’nin terapötik bir etkiye sahip olduğunu ve enflamatuar hastalıkları önlemek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, bir COX-2’ye özgü inhibitör olarak işlev gören artrit ve diğer enflamatuar hastalıkların tedavisi için potansiyel bir ilaç adayı olarak düşünülebilir.

Teşekkür

Bu çalışma 2013 yılında Dankook Üniversitesi araştırma fonu tarafından yürütülmüştür.

Referanslar

1 

Phillips OA, Mathew KT ve Oriowo MA: Sıçanlarda Tribulus terrestris metanolik ve sulu ekstraktlarının antihipertansif ve vazodilatör etkileri. J Etnoparmakol. 104: 351-355. 2006. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik

2 

Adimoelja A: Fitokimyasallar ve cinsel işlev bozukluklarının tedavisinde geleneksel bitkilerin atılımı. Int J Androl. 23 (Ek 2): 82-84. 2000. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

3 

Zhang JD, Cao YB, Xu Z, Sun HH, An MM, Yan L, Chen HS, Gao PH, Wang Y, Jia XM ve Jiang YY: Tribulus terrestris L.’den sekiz steroid saponinin in vitro ve in vivo antifungal aktiviteleri. flukonazole dirençli mantar patojenlerine karşı güçlü aktiviteye sahip. Biol Pharm Bull. 28: 2211-2215. 2005. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

4 

Chu S, Qu W, Pang X, Sun B ve Huang X: Tribulus terrestris’ten saponinin hiperlipidemi üzerine etkisi. Zhong Yao Cai. 26: 341-344. 2003.Çince. PubMed / NCBI

5 

Amin A, Lotfy M, Shafiullah M ve Adeghate E: Tribulus terrestris’in diyabette koruyucu etkisi. Ann NY Acad Sci. 1084: 391-401. 2006. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

6 

Jiangsu Yeni Tıp Koleji: Çin Bitkisel Tıp Sözlüğü. Şangay Halk Yayınevi; Şanghay: s. 12741977

7 

Lv AL, Zhang N, Sun MG, Huang YF, Sun Y, Ma HY, Hua HM ve Pei YH: Tribulus terrestris’in meyvelerinden yeni bir sinnamik imid dervatif. Nat Prod Arş. 22: 1013-1016. 2008. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

8 

Al-Taweel AM, Perveen S, El-Shafae AM, Fawzy GA, Malik A, Afza N, Iqbal L ve Latif M: Celtis africana’dan biyoaktif fenolik amidler. Moleküller. 17: 2675-2682. 2012. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

9 

Willeaume V, Kruys V, Mijatovic T ve Huez G: Virüslerin ve makrofajlardaki lipopolisakaritlerin neden olduğu tümör nekroz faktörü-alfa üretimi: benzerlikler ve farklılıklar. J İltihap. 46: 1-12. 1996 =.

10 

Xie QW, Whisnant R ve Nathan C: Kalsiyumdan bağımsız nitrik oksit sentaz kodlayan fare geninin promotörü, interferon γ ve bakteriyel lipopolisakkarit ile indüklenebilirlik sağlar. J Exp Med. 177: 1779-1784. 1993. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

11 

Vane JR, Mitchell JA, Appleton I, Tomlinson A, Bishop-Bailey D, Croxtall J ve Willoughby DA: İnflamasyonda siklo-oksijenaz ve nitrik oksit sentazın uyarılabilir izoformları. Proc Natl Acad Sci ABD. 91: 2046-2050. 1994. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik

12 

Nathan C ve Xie QW: Nitrik oksit sentazları: roller, geçiş ücretleri ve kontroller. Hücre. 78: 915-918. 1994. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

13 

Yoon WJ, Ham YM, Yoo BS, Moon JY, Koh J ve Hyun CG: Oenothera Iaciniata, RAW264.7 makrofajlarında lipopolisakkarit kaynaklı nitrik oksit, prostaglandin E2 ve proinflam matory sitokinlerinin üretimini engeller. J Biosci Bioeng. 107: 429-438. 2009. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

14 

Reddy DB ve Reddanna P: Chebulagic asit (CA), RAW 264.7 makrofajlarında NF-kappaB ve MAPK aktivasyonunu baskılayarak LPS kaynaklı iltihabı hafifletir. Biochem Biophys Res Commun. 381: 112-117. 2009. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

15 

Murakami A ve Ohigashi H: Enflamatuar hücrelerde NOX, INOS ve COX-2’yi hedefleme: Gıda fitokimyasalları kullanılarak kemoprevent Int J Kanser. 121: 2357-2363. 2007. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

16 

Hinz B, Brune K ve Pahl A: Prostaglandin E (2), lipopolisakkarit ile uyarılan RAW 264.7 makrofajlarında siklooksijenaz-2 ekspresyonunu düzenler. Biochem Biophys Res Commun. 272: 744-748. 2000. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

17 

Crofford LJ, Lipsky PE, Brooks P, Abramson SB, Simon LS ve van de Putte LB: Spesifik siklooksijenaz-2 inhibitörlerinin temel biyolojisi ve klinik uygulaması. Artrit Rheum. 43: 4-13. 2000. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

18 

Chen T, He J, Zhang J, Li X, Zhang H, Hao J ve Li L: Kenevir tohumunda (Cannabis sativa L. tohumu) baskın radikal süpürücü aktiviteye sahip iki bileşiğin izolasyonu ve tanımlanması. Food Chem. 134: 1030-1037. 2012. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

19 

Ölken NM ve Marletta MA: K G alternatif bir alt-tabaka ve nitrik oksit sentaz, mekanizma esaslı inhibitörü olarak metil-L-arginin fonksiyonlar. Biyokimya. 32: 9677-9685. 1993. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

20 

Uto T, Suangkaew N, Morinaga O, Kariyazono H, Oiso S ve Shoyama Y: Eriobotryae folium özütü, murin makrofajlarda NF-kappaB ve MAPK aktivasyonunu inhibe ederek LPS kaynaklı iNOS ve COX-2 ekspresyonunu bastırır. J Chin Med. 38: 985-994. 2010. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

21 

Yu T, Lee YJ, Yang HM, Han S, Kim JH, Lee Y, Kim C, Han MH, Kim MY, Lee J ve Cho JY: Sanguisorba officinalis etanol özütünün NO ve PGE 2 üretimi üzerindeki inhibitör etkisi baskılama yoluyla gerçekleşir. NF-κB ve AP-1 aktivasyon sinyalleme kaskadı. J Etnoparmakol. 134: 11-17. 2011. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik

22 

Hong CH, Hur SK, Oh OJ, Kim SS, Nam KA ve Lee SK: Kültürlenmiş fare makrofaj hücrelerinde indüklenebilir siklooksijenaz (COX-2) ve nitrik oksit sentazın (iNOS) inhibisyonunda doğal ürünlerin değerlendirilmesi. J Etnoparmakol. 83: 153-159. 2002. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

23 

Dawson TM, Dawson VL ve Snyder SH: Beyindeki yeni bir nöronal haberci molekül: serbest radikal, nitrik oksit. Ann Neurol. 32: 297-311. 1992. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

24 

Dinarello CA: Proenflamatuar sitokinler. Göğüs. 118: 503-508. 2000. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

25 

Walker G, Pfeilschifter J ve Kunz D: İnterferon (IFN) -gamma ile uyarılan RAW 264.7 hücrelerinde uyarılabilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ekspresyonunun deksa-metazon ile baskılanma mekanizmaları. Transkripsiyon sonrası regülasyonda önemli bir adım olarak iNOS proteininin kalpain ile glukokortikoide bağlı bozunması için kanıt. J Biol Chem. 272: 16679-16687. 1997. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

26 

Boumpas DT, Chrousos GP, Wilder RL, Cupps TR ve Balow JE: İmmün aracılı hastalıklar için glukokortikoid tedavisi: temel ve klinik korelasyonlar. Ann Intern Med. 119: 1198-1208. 1993. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

27 

Mitchell JA, Larkin S ve Williams TJ: Siklooksijenaz-2: inflamasyonda düzenleme ve alaka düzeyi. Biochem Pharmacol. 50: 1535-1542. 1995. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

28 

Chiba A, Mizuno M, Tomi C, Tajima R, Alloza I, di Penta A, Yamamura T, Vandenbroeck K ve Miyake S: Selekoksibin 4-trifloro-metil analogu, doğuştan gelen bağışıklık hücresi aktivasyonunu baskılayarak artriti inhibe eder. Artrit Res Ther. 14: R92012. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik

29 

Salvemini D, Misko TP, Masferrer JL, Seibert K, Currie MG ve Needleman P: Nitrik oksit, siklooksijenaz enzimlerini aktive eder. Proc Natl Acad Sci ABD. 90: 7240-7244. 1993. Makaleyi Görüntüle : Google Akademik : PubMed / NCBI

Bir cevap yazın